Blue Sky LabМетоди на работа
Какви методи в лабораторната диагностика за животни използваме
PCR технологията е съвременен метод и златен стандарт при диагностиката на редица инфекциозни заболявания.
Притежава много предимства пред класическите методи като например: висока чувствителност и специфичност, бързина.
Чрез PCR можем да докажем директното наличие на нуклеинови киселени от търсения патоген в проба, а при необходимост да направим и количествено определяне
PCR диагностика
Полимеразна верижна реакция (Polymerase chain reaction, PCR) е високо чувствителен и специфичен метод за директна детекция на инфекциозни агенти, широко използван за създаване на много голям брой (милиони до милиарди) копия на избрани къси участъци от конкретна ДНК (таргетна ДНК), взета от много малко количество проба. Чрез PCR се възпроизвеждат и откриват генни последователности, характерни за съответния патоген.
PCR е разработен през 1984 година от американския биохимик Kary Mullis и оттогава е намерил много разнообразно и широко проложение. За откритието си Mullis получава Нобелова награда през 1993 година.
Методът е високочувствителен и във ветеринарната медицина може да се използва за откриване на бактериална, вирусна или протозойна ДНК в малки количества проби от кръв, секрет или тъкан на пациента.
Високата чувствителност на PCR позволява откриване на вируси скоро след инфекцията и дори преди клиничното начало на заболяването.
В кои случаи се препоръчва провеждането на изследването?
Приложенията на PCR са разнообразни и включват:
Поставяне на диагноза - това е особено полезно, когато болестотворните агенти се изолират трудно върху хранителна среда или са малък брой в проба
Преди приложение на антибиотик или антипротозойно лекарство за потвърждаване на активна инфекция
За определяне вида на патогена, което дава възможност да се избере подходящ клас медикамент
След завършване на лечението, за да се потвърди излекуване на инфекцията
Какво е PCR
PCR е поредица от повтарящи се стъпки цикли, които протичат в един и същи разтвор. Цикличността се осъществява чрез бърза промяна на температурата на разтвора, който съдържа изследваната ДНК, праймери (олигонуклеотиди, които са комплементарни на определени участъци на изследваната ДНК), дезокси-нуклеотид-три-фосфати (структурни елементи за изграждане на дъщерните вериги ДНК), буфер, термоустойчив ензим. Фазите на циклите са следните:
1. Денатурация: Разделяне на двойната спирала на ДНК на две комплементарни вериги чрез повишаване на температурата.
2. Анилинг: Температурата се понижава за да се извърши комплементарно свързване на праймерите с таргетните участъци, като те служат за начални точки за работа на ензима.
3. Удължаване: Ензимът, обикновено TAQ полимераза е термоустойчив ензим (оригинално извлечен от термофилни микроорганизми), извършващ удължаване на веригата на ДНК, като присъединява нуклеотиди, комплементарни на матрицата. Така се синтезират аналогични на изследваната ДНК вериги, но с по-малка дължина.
След извършването фазата на удължаване следва нов цикъл. При това всеки новосинтезиран фрагмент от ДНК служи за нова матрица за работата на ензима. Количеството на ДНК се увеличава в геометрична прогресия (амплификация), като е представена главно от вериги с еднаква дължина.
Именно наличието на голямо количество еднакви фрагменти позволява търсеният участък да бъде визуализиран. В класическият вариант, наричан още EP PCR (End point PCR) това става след електрофореза в агарозен гел, като се визуализира чрез директно наблюдение при облъчване с ултравиолетова светлина и „оцветяване“ с флуоресцентни багрила като етидиев бромид.
При правилно подбрани праймери можем да установим дали имаме една или повече таргетни вериги, както и дължината им. Това дава информация за наличие или отсъствие на дадени гени или мутация.
Real-Time PCR
qPCR (Real-time PCR) е реакция в реално време. Тя е с по-висока чувствителност и специфичност. Позволява количествено определяне на патогена в пробата. Основата на метода е ползването на багрила, които се свързват с двойната спирала и при облъчване отделят светлина с определена честота на вълната или такива, които са свързани с праймери и „светят“ при тяхното отделяне от веригата в резултат на дейността на полимеразата. Според интензитетът на излъчваната светлина от пробата може да се съди за количеството на намножените фрагменти в реално време и да се определи количеството на търсената ДНК в пробата.
Amplification curve 
Taqman technology RT (reverse transcription) PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) Позволява ползването на РНК като матрица за протичане на реакцията и съответно нейното идентифициране в пробата. РНК се ползва за синтез на комплементарна ДНК, която участва по нататък в реакцията. За това се ползва ензимът обратна транскрибтаза. За успешно получаване на валиден резултат са изключително важни чистотата на пробата, както и качеството (запазеност) на РНК.
